研究背景：当前测定食品还原糖广泛使用的测定方法主要有3,5-二硝基水杨酸(DNS)法、葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂盒(GOPOD)法和荧光辅助糖电泳(FACE)法，其中NDS法和GOPOD法具有快速便捷、价格低、易操作的优点。但有部分从业人员发现在尝试采用DNS法和GOPOD法测定含茶多酚的还原糖体系时，茶多酚的存在可能会干扰还原糖测定结果的准确性。
基于以上因素，本研究选取了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸、原花青素和阿魏酸4种典型酚类物质(图1)，分别以单独的酚类、酚类与葡萄糖共混、酚类与淀粉酶解物共混体系为样品，研究酚类物质对DNS法、GOPOD法和FACE法定量测定还原糖的影响，以期找到适用于多酚共存体系中还原糖的检测方法。(结论见末尾)
一、 酚类对DNS法测定还原糖含量的影响
DNS法测定还原糖的本质是利用氧化还原反应原理，即3,5-二硝基水杨酸的硝基被还原糖还原为氨基显色，而还原糖被氧化成糖酸(图2A)。
图2A 酚类参与DNS反应示意图
将单独的酚类、酚类与葡萄糖共混、酚类与淀粉酶解物共混体系3类不同样品体系与DNS进行显色反应，结果表明，EGCG、没食子酸、原花青素代表的3类酚类物质都会与DNS发生显色反应(图2C)且具有浓度依赖性(图2B、图2D、图2E)，根据单色光吸光度具有线性加和特性，因此在线性浓度范围内可通过调整试验参比排除酚类影响。
二、 酚类对GOPOD法测定还原糖含量的影响GOPOD法的原理是葡萄糖经过葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢进一步在过氧化酶的作用下，将还原性的4-氨基安替比林与酚偶联缩合成红色的醌亚胺类化合物质(图3A)。
图3A 酚类参与GOPOD反应的示意图
采用GOPOD法检测EGCG、原花青素、没食子酸和阿魏酸分别与葡萄糖共混体系中的还原糖含量，发现吸光度都会显著降低，说明4种酚类物质参与了GOPOD反应过程(图3B)。而EGCG和原花青素质量浓度为10 mg/mL时，与葡萄糖相比，吸光度显著增加(P<0.05)，这是由于高浓度EGCG或原花青素与试剂盒反应产生悬浊物。因此，GOPOD法并不适用于茶食品中还原糖的直接测定。
图3B 酚类-葡萄糖混合物与葡萄糖试剂盒反应的实物图
三、 酚类对FACE法测定还原糖含量的影响
FACE法的原理是还原糖与ANTS发生衍生化形成不稳定亚胺，然后通过氰基硼氢化钠选择性还原亚胺形成稳定胺，再通过聚丙烯酰胺凝胶将反应样品电泳分离出不同聚合度的还原糖ANTS衍生物(图4A)。从原理上推测，多酚无醛基不能参与ANTS衍生反应。
结果显示，FACE法能分离葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、 麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖，并且在4种酚类物质对应的泳道上无荧光条带，验证了EGCG、没食子酸、原花青素、阿魏酸不参与ANTS衍生反应(图5A)。进一步采用不同浓度的酚类物质与淀粉酶解物(低聚还原糖)共混，研究共混样品的FACE荧光显色情况，发现酚类-淀粉酶解物的荧光条带分布及强度与对照淀粉酶解物无显著差异，说明酚类不影响低聚还原糖的测定(图5B、图5C、图5D)。因此，采用FACE法测定还原糖是科学可行的。与DNS法和GOPOD法相比，FACE法还可同时获得淀粉酶解物中低聚糖的分布情况，有助于阐释酚类物质对淀粉酶的酶解特性及酶解产物的影响。
四、结论1. 对DNS法而言，阿魏酸无影响，而EGCG、没食子酸和原花青素能够与DNS发生显色反应且呈浓度线性相关性，增加了DNS法测定的吸光度，意味着酚类物质的存在可能会使常规DNS法测定结果偏高，建议通过更换参比进行方法改良。2. 对GOPOD法而言，EGCG、没食子酸、原花青素和阿魏酸均能参与酶促反应生成显色物质，导致测定结果偏离真值，因此该方法应用时需考虑去除体系中的酚类物质再测定还原糖。3. 对FACE法而言，4种酚类物质均对FACE法无干扰，且FACE法还能同时获得低聚还原糖的分布信息，是定量测定含酚类物质体系中还原糖含量的良好方法。
本文节选自《茶叶科学》2023年第4期，P567-575，《茶多酚对茶食品中还原糖检测方法的影响》，作者：盛政，杜文凯，王崇崇，张博安，张海华*，杜琪珍*。
来源：中国茶叶
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