鞣花酸(Ellagic acid，EA)是一种具有生物活性的酚类化合物，广泛存在于水果、坚果等植物组织中，其结构如图1所示，是一种没食子酸的二聚衍生物。在自然界中，鞣花酸主要以缩合形式(如鞣花单宁等)存在。鞣花酸基本无毒性，对化学物质诱导的癌变及其它多种癌变具有明显的抑制作用，如结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴癌等。此外，鞣花酸还具有抗氧化、抗炎症、抑菌、抑制黑色素生成、改善白血病等功效。由于其优异的生物活性，鞣花酸被广泛应用于保健食品、医疗、医药、化妆品等领域。
有研究表明，茶叶是鞣花单宁和鞣花酸的重要膳食来源，鞣花单宁通过人体肠道微生物转化，会转化为鞣花酸等代谢产物。
▲ 人体代谢路径
普洱熟茶作为云南名茶，是由云南大叶种晒青毛茶制成的一种独特微生物发酵茶。普洱熟茶“固态发酵”的实质主要是湿热作用、酶作用以及微生物作用。大叶种晒青毛茶发酵过程中，微生物代谢释放大量热量，其分泌的酶与茶叶内含物发生激烈的酶促反应，二者均能促进具有热不稳定性的鞣花单宁(如木麻黄素)分解形成鞣花酸。
建立普洱熟茶中鞣花酸含量的检测方法，可满足普洱熟茶中特征活性成分的质量控制需求，同时有助于江南体育下载平台注册 发酵过程中特征性物质的变化趋势及微生物的代谢规律研究，为江南体育下载平台注册 的工业化可控发酵提供方法依据。
01
材料与方法
1、仪器与设备
Waters e2695 高效液相色谱仪(美国，Waters公司);Waters 2995 PDA(光电二极管列阵检测器，美国，Waters公司);WD-9415B超声仪(北京六一仪器厂);H1850R低温离心机(湘仪离心机仪器有限公司);VORTEX 3旋涡混匀器(德国，IKA公司);分析天平(精度0.0001 g，美国，OHAUS公司);Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国，Agilent公司)。
2、材料与试剂
针式过滤器(0.45 μm，尼龙66，天津津腾实验设备有限公司);乙腈、甲醇均为色谱纯(德国MERCK公司);水为超纯水;磷酸为分析纯;鞣花酸对照品(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)。
3、色谱条件
Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);0~20 min，0.2%磷酸∶乙腈(85∶15，体积比)，等度洗脱;流速：1 mL/min;进样量为10 μL，柱温35 ℃;光电二极管阵列检测器;检测波长245 nm。
4、标准溶液的配制
称取一定量的鞣花酸对照品，用甲醇溶解配制成质量浓度为60 mg/L的标准储备液，于-4 ℃避光保存。使用前，准确移取适量鞣花酸标准储备液，用甲醇配置成质量浓度分别为1~30 mg/L的标准系列工作液，于-4 ℃避光保存。
5、样品处理
称取适量(精确至0.0001 g)均匀研磨的熟茶样品于50 mL离心管中，加入适量提取溶剂(水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、纯甲醇)，使料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，超声一定时间(30 min、45 min、60 min)，5000 r/min下离心10 min，取上清液于100 mL容量瓶中，重复数次(重复0次、1次、2次和3次，即提取1次、2次、3次和4次)，合并上清液，用纯水定容至100 mL，摇匀，过0.45 μm水相滤膜后，待测。
02
结果与分析
1、高效液相色谱条件优化
使用水-甲醇、水-乙腈、磷酸水溶液-甲醇和磷酸水溶液-乙腈(磷酸浓度为0.2%、0.3%、1%)为流动相，等度洗脱，考察不同流动相种类、比例及pH对普洱熟茶中鞣花酸分离效果的影响。从目标峰的峰形、与干扰峰的分离度等方面进行评价。
结果表明，流动相为水-有机相体系时，鞣花酸的色谱峰展宽、拖尾严重，识别困难。在洗脱体系中加入不同浓度的磷酸进行峰形优化，鞣花酸色谱峰的峰宽变窄，峰形对称略有拖尾。但不同浓度的磷酸，对峰形变化影响不明显，因此洗脱体系选用0.2%磷酸的浓度。分别使用甲醇和乙腈有机相洗脱鞣花酸对照品，发现乙腈洗脱体系鞣花酸的保留时间更短，且水溶液-乙腈体积比为85∶15时样品中鞣花酸目标峰前后杂质峰较少，利于定性和定量，能显著提高检测效率。
因此，确定普洱熟茶中鞣花酸定量检测的流动相为0.2%磷酸水溶液-乙腈(体积比为85∶15)，保留时间为16.0 min(±0.5 min)，如图2所示。
2、样品前处理优化
分别研究不同料液比、不同提取液种类、不同提取时间和不同提取次数对鞣花酸提取率的影响。在相同检测条件下对比鞣花酸色谱峰和杂质色谱峰(咖啡因等)的峰高或含量，从而确定最优的前处理方法。
如图3所示，1∶30、1∶40、1∶50提取组鞣花酸含量显著低于1∶20提取组，鞣花酸含量随料液比降低而显著降低，而1∶10、1∶20提取组间鞣花酸含量无显著差异，当料液比为1∶10时，咖啡因峰高超过2.0 AU，没食子酸峰高达1.8 AU，考虑到过大响应值可能对检测器造成损耗，因此，1∶20为最适料液比。
选择水、甲醇以及不同比例甲醇水为提取溶剂，评价普洱熟茶中鞣花酸的提取率。如图4所示，与水提取组相比，纯甲醇、75%甲醇组鞣花酸提取率显著低于水提取组，50%甲醇、25%甲醇组鞣花酸提取率低于水组，但无显著差异，综合考虑实验成本及环境污染等因素，选择水为最适提取液。
考虑不同提取时间对普洱熟茶中鞣花酸提取率的影响。如图5所示，鞣花酸含量随着提取时间的增加而增加，但提取30 min与提取45 min相比无显著差异，为提高检测效率，确定提取时间为30 min。
考虑不同提取次数对普洱熟茶中鞣花酸提取率的影响，根据已确定的料液比(1∶20)、提取液(水)和提取时间(30 min)，分别超声提取1次、2次、3次和4次。如图6所示，鞣花酸含量随着提取次数的增加而增加，提取3次与提取1次和2次相比有显著差异，且与提取4次相比有差异但不显著，考虑到检测时长和检测效率，最终采用3次提取。
3、方法线性范围与相关系数
采用上述所确定的方法检测鞣花酸对照品，外标法定量，以其峰面积为纵坐标(y轴)，其浓度为横坐标(x轴)做标准曲线，线性方程、相关系数见表1。在0.6~60 mg/L范围内鞣花酸的线性良好。鞣花酸的检出限(LOD)为13.5 mg/kg，定量限(LOQ)为检出限的3.33倍，即45.0 mg/kg。
4、仪器精密度、方法重现性
取上述同一鞣花酸标准溶液，重复进样6次，进样量10 μL，以鞣花酸峰面积，计算其相对标准偏差(RSD)为0.28%(n=6)。
根据“1.5”所述，按照最终确定的前处理方法进行同一样品平行实验，每个平行样品进样1次，进样量10 μL，以各样品的鞣花酸含量，计算其相对标准偏差(RSD)为3.7%(n=6)，表明该方法重复性较好。
5、普洱熟茶中鞣花酸的含量
对18个市售普洱熟茶中鞣花酸的含量进行测定，结果见表2。样品中鞣花酸含量范围为176.6~398.1 mg/kg。
03
讨论
不同普洱熟茶中鞣花素含量差异明显。普洱熟茶中的鞣花酸可能由茶叶中的鞣花单宁类物质转化而来，不同等级、不同地区的原料鞣花单宁类物质含量不同，且发酵程度不同也会影响普洱熟茶中鞣花酸的含量，具体的影响因素及影响程度有待进一步研究。
目前，利用高效液相色谱法测定鞣花酸含量的文献中，检测对象多为水果和药用植物，涉及江南体育下载平台注册 中鞣花酸含量的检测方法鲜有报道。部分文献中所述方法提取过程漫长、提取溶液种类复杂且环境危害较大。或因仪器条件配适度较差，目标物与杂质峰未有效分离，导致定量结果不准确。
文章所述方法不仅可用于普洱熟茶中鞣花酸的含量测定，也适用于普洱熟茶深加工产品，且为普洱熟茶发酵过程中鞣花酸变化趋势的研究提供方法基础。现行大部分检测方法使用的提取溶剂为有机试剂，前处理包括长时间浸泡或水浴回流及浓缩、蒸干等步骤，相较于这些方法，本方法仅使用纯水超声提取，方法便捷、成本低廉、环境危害小、可批量前处理。且方法检测周期较短，样品前处理2 h，比其他需要有机试剂预先浸泡数小时再提取的方法更高效。本方法目标峰前后杂质峰少且较小，分离度较文献方法高，可有效定量目标峰。
许芮菁
助理工程师，就职于云南大益微生物技术有限公司、云南省江南体育下载平台注册 发酵工程研究中心，主要从事茶叶及其微生物代谢成分检测研究。参与云南省科技厅重大科技专项子项目。发明专利公开3件，受理3件;在核心期刊发表论文1篇。
具体内容详见《中国茶叶加工》杂志，2022年第2期文章《高效液相色谱法测定普洱熟茶中鞣花酸含量》，页码：63-68，作者：许芮菁，刘敏，杨锐，高林瑞，丁章贵*，陈丹丹*。
来源：中国茶叶加工
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